1. AAV股票代码
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    腺相关病毒股票代码
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    疾病研究(心、、、、肝、、肺)

    疾病研究(心、、肝、、肺)

      基于对病毒载体的深入了解和研发,,,,越来越多的科研人员开始借助病毒载体进行疾病研究。。目前,,,病毒载体工具在不同组织器官中均有大量的应用,,,,通过使用工具病毒载体,,对疾病相关基因进行定向和组织特异性的改造和操控,,,已成为科研人员进行疾病研究与治疗的一种技术手段。。。

      病毒载体的选择
      
      不同病毒载体的大小迥异,,,意味着其内含基因容量存在巨大差异;免疫原性的不同,,,意味着其体内/体外应用的场景需要细微调整;表达时间和周期的不同,,意味着我们需要根据研究需求进行相对应的选择。。

    表1 不同病毒的生物学特性比较
      慢病毒 腺相关病毒 腺病毒 逆转录病毒
    包膜
    颗粒直径 80-100 nm 20-30 nm 90-100nm ~100nm
    基因组 dsRNA ssDNA dsDNA RNA
    基因组大小 9.75kb 4.7kb 36kb ~5kb
    表达起始时间 48-72h 72-96h 24-48h 48-72h
    表达持续时间 > 2 months > 6 months < 1 month > 2 months
    体内扩散能力 一般 一般
    免疫原性 中等 极低 中等
    滴度范围 108~109TU/mL 1012-1013VG/mL 1011-1012PFU/mL 107~108TU/mL
    滴度检测方法 qPCR整合DNA qPCR非整合DNA 抗原抗体免疫染色试剂盒 qPCR整合DNA
    整合方式 随机高频整合 定向低频整合(rAAV不整合) 非整合 随机整合
    应用范围 体外细胞感染,,,gRNA文库筛选,,,,体内 基于不同的血清型,,,体内广泛应用 嗜肝,,,,快速表达或短期表达,,,血液、、、心脏,,,细胞系等  特异性只感染分裂期的细胞
      重组腺相关病毒载体(rAAV),,,,一直是体内研究的明星载体,,,,除了其免疫原性极低、、、安全性高、、、、宿主细胞范围广、、扩散能力强、、、体内表达基因时间长等优势外,,,,还在于其种类多样性。。。
      
      现在研究中常用的rAAV就是利用AAV2型基因组与不同的衣壳蛋白结合产生的混合体病毒载体,,一般标记为rAAV2/N (N为不同的衣壳血清型)。。。重组的病毒具有AAV2型的稳定表达和基因整合能力,,同时获得了不同血清型的组织感染嗜亲性,,表现出一定的器官靶向特异性。。。
    表2 不同血清型AAV的组织嗜亲性
    血清型 组织亲和性
    rAAV2/1 神经系统(高滴度顺向跨突触),,,,肌肉,,骨骼肌,,心肌,,,,平滑肌
    rAAV2/2 神经系统,,,肌肉,,,,肝脏,,,血管平滑肌,,,,眼
    rAAV2/3 肌肉,,,肝脏,,,肺,,,,眼
    rAAV2/4 神经系统,,肌肉,,眼,,脑
    rAAV2/5 神经系统,,,,肺,,,,视网膜,,,,肝脏,,,滑膜关节
    rAAV2/6 神经系统,,,肺,,,,肌肉,,,,心脏
    rAAV2/7 肌肉,,肝脏
    rAAV2/8 神经系统,,肝脏,,胰腺,,视网膜,,,脂肪组织
    rAAV2/9 神经系统,,,心肌,,,,肺,,,,视网膜,,,皮肤,,肌肉,,,,脂肪组织
    rAAV2-retro 神经系统(逆向非跨突触)
    AAV-PHP.eB 跨血脑屏障(静脉注射)
    AAV-PHP.S 全外周神经(尾静脉注射)
    AAV-PAN 胰腺(腹腔注射)
    AAV-LUNG 肺(尾静脉注射)
    AAV-DJ 视网膜,,,,肺,,,肾脏,,,体外感染细胞
    AAV-7m8 视网膜
    AAV-ShH10Y 视网膜Muller细胞
    AAV-Rh10 肝脏,,血液,,,心脏,,,,体外感染细胞
    AAV-Anc80L65 内耳、、、、视网膜、、、、骨骼肌、、肝脏
    AAV-SCH9 SVZ区神经干细胞
     
      小建议:如您不确定选择哪种血清型,,,,可尝试使用智迪保生物Pandora’s Virus (AAV试用装)进行预实验,,通过比较不同血清型对目标组织的感染效果,,,摸索最佳实验条件(注射方法、、注射位点、、、、病毒用量等),,以便得到更理想的实验结果。。(链接到Pandora’s Virus>>)

    肝脏

      肝脏是调控机体脂质代谢、、、血糖代谢的重要器官,,,其功能异常会导致脂肪肝、、高胆固醇血症、、高血脂症、、、、糖尿病等疾病。。
      
      1、、、注射方式
      
      应用病毒载体感染肝脏一般采用尾静脉注射的方式。。
      
      按照智迪保生物多年的经验,,,使用AAV载体感染肝脏组织一般选取AAV2/8血清型,,通过尾静脉注射手段感染肝脏每只小鼠需要注射1x1010总滴度的病毒载体。。。。
     
      
      智迪保生物AAV感染结果
      
      2、、、应用案例
      
      2.1 肝脏特异启动子TBG
      
      客户发表文章:FASEB Journal. (IF=5.391). Yang Y,et.al. (2018). Long-term exercise prevents hepatic steatosis: a novel role of FABP1 in regulation of autophagy-lysosomal machinery. [非酒精性脂肪肝,,,自噬溶酶体,,腺相关病毒过表达]
    `
      
      注射方式:小鼠尾静脉注射
      
      载体:AAV8-TBG-Fabp1
      
      血清型:rAAV2/8
      
      注射量:200ul,,2× 1011 VG
      
      观察时间:1周
      
      2.2 Cre-loxp技术在小鼠肝脏中的应用
      
      由于腺病毒高度嗜肝,,,几乎90%以上会感染肝脏,,,因此腺病毒可以作为肝脏特异性感染的有效载体。。。将Cre腺病毒(Ad-Cre)通过尾静脉注射入带有loxp小鼠体内,,,即可实现肝脏特异性表达并将目的基因敲除,,从而快速获取肝脏特异性基因敲除小鼠。。。
      
      2.3 CRISPR/Cas9技术在小鼠肝脏中的应用
      
      通过腺病毒将CRISPR/Cas9系统相关元件(Cas9和sgRNA)注射入小鼠体内,,,可以实现在肝脏中特异性表达,,,,并实现肝脏部位的特异性敲除。。。。此方法比较适合检验活体实验。。。

    胰腺

      胰腺是一个兼有内、、外分泌功能的器官,,与机体消化、、、血糖代谢、、、、脂质代谢等有密切的关系,,,也是代谢研究的关键目标器官之一。。。。
      
      在实际研究中,,,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,,一种是使用AAV2/8病毒载体,,,,通过胆管将病毒注射入胰腺;另一种新方法是使用智迪保生物新研发的AAV-PAN病毒载体,,,,腹腔注射感染胰腺:
    智迪保生物AAV-PAN感染结果

    心脏

      1、、、、注射方式
      
      AAV的注射方式,,,,不同的文章中采用了不一样的注射方式。。总体上,,,,一般包括静脉注射、、、心腔内注射、、、心肌内定点注射、、、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),,,,其中静脉注射包括尾静脉注射、、、、颈静脉注射、、、面部静脉注射等。。
      
      尾静脉注射和心腔内注射由于病毒流进血液循环,,分布较均匀。。心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,,,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,,,,对手术操作要求较高。。心肌内定点注射时每点注射2-5ul,,效果是在注射的局部点附近表达较高,,,但扩散非常有限。。总的来说,,,,很多实验直接用尾静脉注射即可,,,,但是可能需要较高剂量的病毒,,如果用心肌内定点注射,,,,即小量多点注射,,,可以达到很好的感染表达效果,,但是后者操作技术难度略高,,,也需要花费更长的操作时间。。
      
      结合新生鼠(出生2-10天)注射效果比较来看,,,新生鼠注射表达效果大大优于成年鼠,,,消耗病毒剂量也相对较低。。。。新生鼠的注射,,一般根据实验室的条件来看,,可以选择颈静脉注射、、、面部静脉注射和心腔内(左心室)注射,,,目的是将病毒导入血液循环中。。
      
      2、、、、启动子选择
      
      一些常用启动子如CMV、、CAG、、、、αMHC、、、、cTnC等常被用于驱动在心脏组织中的表达。。。。很多高效的启动子由于片段较大,,,如αMHC,,,,仅用于转基因小鼠等实验,,不适合装载在AAV载体上。。。通过查阅文献,,,我们发现一些小的启动子如CMV在心脏组织的表达能力比较强,,特别对于大片段的驱动效果很明显,,,,但是如果需要介导的目的基因在心脏中特异性表达,,,则推荐使用cTnT启动子,,,cTnT常被用于心肌的特异性表达,,表达能力也很强。。。
      
      3、、应用案例
      
      3.1 心脏特异性启动子cTNT
      
      客户发表文章:Yue Z, et al., (2019) PDGFR-b Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Rep.
      
      注射方式:
      
      载体:AAV9
      
      血清型:rAAV2/9
      
      启动子:cTnT
      
      注射量:200ul,,,2× 1011 VG
      
      观察时间:1周
      
      3.2 Cas9心脏特异性转基因小鼠
      
      科学家构建了带有eSpCas9(1.1)的心脏特异性转基因小鼠,,,通过Myh6基因的启动子(αMHC)驱动Cas9在心肌的特异性表达。。。αMHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。。。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。。。。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达,,,,而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。。
      
      Cas9转基因小鼠,,只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现,,,这种方法可以获得比较高的编辑效率。。。研究人员将靶向Myh6基因外显子sgRNA通过装载在AAV载体上注射入小鼠,,,实现心脏特异性敲除。。Myh6表达水平降低50%以上,,同时成功得到发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。。。。

    肺部

      目前对于肺部的病毒感染,,普遍采用AAV病毒载体,,使用病毒载体感染胰腺主要有两种方式,,,一种是使用AAV2/9病毒载体,,,,通过鼻内或气管内递送(经呼吸道)将病毒通过肺呼吸道递送,,参考剂量是1×1011VG病毒,,,,体积50ul;另一种新方法是使用智迪保生物新研发的AAV-LUNG病毒载体,,,,尾静脉注射特异性感染肺部:
      

      智迪保AAV-LUNG感染肺部结果

    肌肉

      目前,,,对于肌肉组织中使用的病毒载体通常会选用AAV病毒载体,,,因为AAV不仅能够高效特异地靶向肌肉组织,,,且能在肌肉组织中表达持久。。。。腺病毒使用时容易引起较强的免疫反应,,并且很容易被清除,,表达时间比较短暂,,较少被应用于肌肉组织的靶向表达。。。尽管慢病毒感染表达范围广泛,,,对培养的肌肉细胞均能高效表达,,,但是对肌肉组织的感染表达非常有限。。。。目前靶向肌肉的AAV载体血清型主要为AAV1,,,,AAV6和AAV9。。其中,,,AAV9的表达效率最高,,,并且更容易在肌肉中高表达。。。。
      
      1、、、、注射方式
      
      应用病毒载体感染肌肉组织进行研究,,,,一般分为系统注射和肌肉内注射,,,系统注射表达较均匀,,,但是大部分病毒会被其他脏器组织吸收,,导致靶向肌肉的病毒较少。。。肌肉内注射是一种定点注射,,,可以在注射点附近高效表达,,,,但缺点是病毒扩散十分有限,,,因此往往需要多点注射,,,,一般每个点在5-10ul。。。
      
      2、、、应用案例
      
      注射方式:静脉注射
      
      载体:AAV-CMV-miniDystrophin
      
      血清型:rAAV2/9
      
      观察时间:16周

    脂肪组织

      脂肪组织由大量脂肪细胞组成,,分为白色脂肪、、棕色脂肪和米色脂肪组织,,,脂肪组织是机体冗余能量储存的重要器官,,,同时也是重要的分泌器官,,,,在机体的血糖代谢、、、、脂质代谢、、、慢性炎症、、、、伤疤修复等中有重要的生理功能。。。。
      
      研究中,,,如果我们使用病毒载体感染脂肪组织,,,一般采用定点注射的方式。。使用AAV病毒载体感染脂肪组织一般选取rAAV2/8血清型,,在脂肪组织的多点注射中,,每个点注射量大约1x1010总滴度的病毒载体。。

      AAV感染脂肪

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